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趙方慶（左二）與團隊成員查看測序數(shù)據(jù)情況。課題組供圖

■本報記者 唐鳳

實際上，核糖核酸（RNA）不總是“一條線”，這種遺傳信息載體也會是一個圈。環(huán)形RNA則是一類非常特殊的RNA分子。大量研究表明，它在腫瘤發(fā)生和天然免疫過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，但人們一直缺乏對其進行有效測定的手段。

近日，中科院北京生命科學研究院趙方慶團隊提出了基于三代納米孔測序技術對環(huán)形RNA全長直接測定的實驗和分析流程——CIRI-long。相關論文刊登于《自然—生物技術》。研究人員利用隨機引物對環(huán)形RNA進行的滾環(huán)反轉錄擴增后，使用納米孔測序技術對環(huán)形RNA的全長序列進行直接測序，并實現(xiàn)了對長測序讀段中的環(huán)形RNA序列進行識別和全長重構。

中科院上海營養(yǎng)與健康研究所研究員楊力和博士馬旭凱認為，該研究為深入探索復雜的環(huán)形RNA生成加工奠定了基礎。

獲得整張圖的全貌

環(huán)形RNA廣泛存在于真核生物中。目前研究表明，在生物體內(nèi)，環(huán)形RNA主要通過其序列特征，發(fā)揮miRNA海綿、RBP海綿以及翻譯短肽等重要的生物學功能。

由于具有首尾相連的環(huán)形結構，環(huán)形RNA在細胞中結構更穩(wěn)定，也存在更強的積累效應。因此，科學家可以利用人工設計的環(huán)形RNA分子，在細胞中穩(wěn)定表達目標蛋白。同時，環(huán)形RNA在腫瘤生物標記物和作為治療靶點等多個方面具有重要的應用前景。

但因為環(huán)形RNA序列本身和普通線性RNA高度相似，常用的二代轉錄組測序技術往往難以獲得完整的環(huán)形RNA全長序列。

此前，趙方慶團隊的研究方向之一就是利用高通量測序技術對環(huán)形RNA進行識別?！巴ㄟ^多年研究，我們深切體會到了傳統(tǒng)二代測序技術對于環(huán)形RNA研究的局限性?！壁w方慶告訴《中國科學報》。

隨著新一代測序技術的發(fā)展，基于納米孔的長讀長測序技術已經(jīng)在很多領域得到廣泛應用。這種測序方法可以一次測定非常長的序列，由此研究人員想到，可否使用該技術研究環(huán)形RNA分子結構。

“從測序數(shù)據(jù)中區(qū)分環(huán)形RNA和線性RNA，類似于同時拼兩幅只有幾塊不一樣的拼圖?！闭撐牡谝蛔髡邚埥痍柛嬖V《中國科學報》，“由于兩者很相似，只有接頭位點具有特異性結構，因此利用短讀長測序技術，很難區(qū)別這些‘小塊’源于線性還是環(huán)形分子。利用長讀長技術則可以一次獲得整張圖的全貌，簡便地實現(xiàn)對環(huán)形RNA序列的直接鑒定?！?/p>

效率提高20倍

研究人員通過大量實驗，優(yōu)化了環(huán)形RNA的富集方法，利用滾環(huán)反轉錄的方式，獲得了含有多個環(huán)形RNA全長序列的cDNA片段。他們利用超長讀長技術，對環(huán)形RNA的全長序列進行了直接測定。研究人員還開發(fā)了相應的計算軟件，在測序數(shù)據(jù)中對環(huán)形RNA的全長序列進行識別和錯誤校正。

通過比較，研究人員發(fā)現(xiàn)，改進后的方法可以有效富集環(huán)形RNA序列，對環(huán)形RNA的檢測效率提升了近20倍。同時，CIRI-long大幅增強了環(huán)形RNA的識別能力，對長度較長的環(huán)形RNA也可以進行有效識別。

趙方慶提到，評估顯示CIRI-long可靠性高，且可以識別來自線粒體基因組以及轉錄本通讀事件的環(huán)形RNA分子，并實現(xiàn)與二代測序相近的分析成本。

近期多個研究也發(fā)現(xiàn)，線粒體中可以產(chǎn)生大量環(huán)形RNA分子，并且可能具有調(diào)節(jié)線粒體活性氧輸出的重要功能。因此科學家利用CIRI-long方法，可以有效識別這類特殊環(huán)形RNA分子，并為其存在提供進一步的證據(jù)。

隨后，研究人員利用新方法對小鼠大腦組織中的環(huán)形RNA進行了深入研究，并發(fā)現(xiàn)了一類新型環(huán)形RNA分子。這類分子由內(nèi)含子的全長序列首尾相接組成，具有特殊的剪接信號，可能代表著一種未發(fā)現(xiàn)的環(huán)形RNA產(chǎn)生途徑。

線性、環(huán)形RNA有待“一網(wǎng)打盡”

總的來說，該方法建立了針對環(huán)形RNA全長的高效識別手段，為環(huán)形RNA的功能挖掘提供了重要的研究平臺和工具。利用該方法，研究人員可以對環(huán)形RNA的全長進行大規(guī)模測定，并基于全長序列進行功能預測，也為設計環(huán)形RNA治療靶點提供了重要的研究工具。

復旦大學的張朝以及美國得克薩斯農(nóng)工大學的韓冷認為，研究結果凸顯了該方法在鑒定環(huán)形RNA和探索環(huán)形RNA形成機制等方面的重要意義。值得注意的是，費城兒童醫(yī)院的邢毅團隊近期開發(fā)的isoCirc也實現(xiàn)了基于三代測序?qū)Νh(huán)形RNA全長的高效重構。這些方法提升了環(huán)形RNA的檢測效率，并能有效重構環(huán)形RNA的全長結構，為后續(xù)研究環(huán)形RNA的功能機制及轉化應用等打下了堅實基礎。

不過，CIRI-long方法仍有一定局限性。由于環(huán)形RNA在生物體內(nèi)含量很低，在目前研究過程中，研究人員采用多步實驗手段針對環(huán)形RNA進行富集。因此，該方法只能實現(xiàn)對環(huán)形RNA的高靈敏度檢測，無法開展對線性RNA和環(huán)形RNA的同時研究。因此，未來仍需對環(huán)形RNA測序作進一步改進。

接下來，趙方慶團隊將繼續(xù)研究長讀長測序技術在環(huán)形RNA研究中的應用，結合實驗技術與計算方法，對環(huán)形RNA的生物學功能和應用進行深入挖掘。

相關論文信息：https://dx.doi.org/10.1038/s41587-021-00842-6