剪切、復制、粘貼，消除不需要的基因片段，換上想要的基因片段，這就是基因組編輯技術(shù)，它猶如一把“基因剪刀”，被科學家應(yīng)用在各種動植物的基因修復與改造之中，為醫(yī)學、健康、農(nóng)業(yè)等方面帶來了突破性的革命。

為了更精準地實現(xiàn)基因組編輯，近年來，科學家不斷探索更多方法發(fā)展基因組編輯技術(shù)。

中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所研究員高彩霞團隊與李家洋院士團隊合作開發(fā)了高效設(shè)計pegRNA以及提高植物引導編輯效率的新策略，為實現(xiàn)植物基因組功能解析和作物精準育種提供了強有力的技術(shù)支撐。相關(guān)研究成果于3月25日凌晨在線發(fā)表于《自然—生物技術(shù)》。

更精準的“夢想”

2019年10月，哈佛大學教授劉如謙（David Liu）團隊開發(fā)了全新的基因組引導編輯技術(shù)（Prime Editing），該技術(shù)能夠在基因組的靶位點處實現(xiàn)精準的片段插入、刪除及堿基的任意替換，被稱為是“超越CRISPR”的重大突破。

引導編輯系統(tǒng)由兩部分構(gòu)成：其一，是nCas9 (H840A)與工程化改造的逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase, RT）組成的融合蛋白；其二是包含PBS（Primer Binding Site）序列和RT模板（RT template）序列的pegRNA（Prime Editing Guide RNA）。

2020年，高彩霞團隊擴展了引導編輯技術(shù)的應(yīng)用，首次在水稻和小麥中成功建立并優(yōu)化了適用于植物的引導編輯器（Plant Prime Editor, PPE），為實現(xiàn)農(nóng)作物精準基因組編輯提供了技術(shù)支撐。

“目前版本的引導編輯器在植物中的工作效率依舊偏低，需要進一步優(yōu)化。”高彩霞研究員告訴《中國科學報》，“我們之前的研究發(fā)現(xiàn)植物的引導編輯效率很大程度上受到PBS序列和RT模板序列的影響，這暗示著，對pegRNA序列進行合理設(shè)計對提高引導編輯效率有很大幫助?！?/p>

兩種新策略

如何提升引導編輯效率并快速獲取高效形式的pegRNA，是植物引導編輯技術(shù)亟需解決的問題。

一開始，研究人員設(shè)計實驗篩選高效形式的pegRNA，并希望能找到一般性的規(guī)律， 然而，事與愿違。常規(guī)實驗方法費時費力，限制了引導編輯技術(shù)在植物中的應(yīng)用。

研究人員另辟新路。

由于引導編輯系統(tǒng)的PBS序列與非靶標鏈結(jié)合是起始逆轉(zhuǎn)錄過程的重要條件，而熔解溫度（Melting Tempreture, Tm）決定了兩條鏈結(jié)合的緊密程度，因此，他們推測PBS的Tm值很有可能對引導系統(tǒng)的編輯效率有重要影響。

為驗證推測正確與否，研究人員在18個內(nèi)源位點進行了測試，結(jié)果表明，當PBS的Tm值為30℃左右時，引導編輯效率在多數(shù)水稻內(nèi)源位點上達到最高，并且隨著溫度的增高或降低均呈現(xiàn)遞減的趨勢。這也驗證了他們的猜想。

研究人員還設(shè)想，對一個DNA位點的正鏈和負鏈都各設(shè)計一個pegRNA，利用DNA兩條鏈之間存在反向互補序列，是否可能會同時“啟動”細胞中的其它修復途徑，共同提高引導編輯系統(tǒng)的編輯效率。

他們在15個水稻內(nèi)源位點測試了該策略，結(jié)果表明，該策略與分別遞送單個pegRNA的方法相比效率平均可以提升3.0倍。他們將該改進策略命名為“雙pegRNA策略”。

另外，實驗還表明，運用SpG變體可以進一步拓展雙pegRNA策略的編輯范圍。

建立新平臺

國際同行專家給出了高度評價，“鑒于引導編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，該工作將對基因組編輯領(lǐng)域內(nèi)產(chǎn)生很大影響?！?/p>

“pegRNA的設(shè)計相對復雜，如何建立一個平臺，幫助需要科研人員針對所需位點進行合理的設(shè)計，幫助他們構(gòu)建高效的引導編輯策略，方便大家使用。在這方面李家洋老師團隊非常有經(jīng)驗?！备卟氏颊f。

為此，基于上述兩個策略，研究人員開發(fā)了植物pegRNA設(shè)計網(wǎng)站PlantPegDesigner（http://www.plantgenomeediting.net/）。

該網(wǎng)站可以提供一系列的參數(shù)供使用者根據(jù)需要進行個性化選擇，并可以推薦完整的pegRNA選擇、設(shè)計與構(gòu)建方案，方便使用者快速篩選高活性pegRNA。實驗結(jié)果表明，與常規(guī)設(shè)計方案或其他pegRNA設(shè)計網(wǎng)站相比，該網(wǎng)站設(shè)計的pegRNA具有更高的編輯效率。

實現(xiàn)重要農(nóng)作物精準基因組編輯對加快農(nóng)作物遺傳改良進程具有重要意義。下一步，研究團隊將繼續(xù)優(yōu)化策略，提升網(wǎng)站平臺，為作物品種改良等提供更高效精準的新工具。

相關(guān)論文信息：https://doi.org/10.1038/s41587-021-00868-w

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圖：植物高效引導編輯設(shè)計策略。（a,b）PBS的Tm值指導pegRNA設(shè)計的示意圖及其對PPE在水稻中編輯效率的影響。（c,d）雙pegRNA策略的示意圖及其對PPE編輯效率的提升。（e）PlantPegDesigner在線設(shè)計網(wǎng)站的工作流程。（課題組供圖）



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